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Introduction

生物反應(yīng)器是用于微生物和細胞的體外培養(yǎng)，并通過生化反應(yīng)或發(fā)酵過程獲取產(chǎn)物的裝置，是生物合成、生物發(fā)酵、生物制藥領(lǐng)域中關(guān)鍵的設(shè)備之一。而平行生物反應(yīng)器可同一系統(tǒng)控制多個單元，使其保持各項參數(shù)的高度一致性，是合成生物學(xué)產(chǎn)業(yè)化關(guān)鍵技術(shù)工藝設(shè)計方案重要的環(huán)節(jié)，其核心功能是高通量篩選（high-throughput screening）和工藝放大。

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Application

Background

藻藍素（Phycocyanobilin，PCB）天然存在于藍藻光感應(yīng)系統(tǒng)中，在光能的吸收和傳遞中起著至關(guān)重要的作用，在光遺傳學(xué)的研究中被廣泛應(yīng)用。由于其具有亮麗的天藍色，可以作為天然色素在食品飲料中呈色，安全健康，營養(yǎng)豐富，是FDA唯一批準(zhǔn)的藍色食品添加劑。PCB還具有抗氧化、消除自由基、修復(fù)細胞延緩衰老、保水抗凍的作用，廣泛應(yīng)用于化妝品領(lǐng)域。此外，作為一種安全的藥物，口服PCB在體內(nèi)可以轉(zhuǎn)化為NADPH氧化酶的有效抑制劑，在治療阿爾茨海默癥方面表現(xiàn)出巨大潛力；PCB對冠狀病毒主要蛋白酶的活性也具有潛在的抑制作用，有潛力應(yīng)用于防治近年來爆發(fā)的新型冠狀肺炎病毒。目前，PCB的獲取方法主要采用高溫甲醇分解法從螺旋藻中提取。該方法存在諸多問題：（1） 甲醇高溫?zé)峤庑枰馁M大量的能量，造成能源浪費；（2） 螺旋藻中與PCB共存的其他色素，如葉綠素、葉黃素等一系列前體，對后期產(chǎn)物純化有不利影響；（3）螺旋藻生長周期較長，限制了藻藍素的生產(chǎn)效率和應(yīng)用。因此，從天然藻類中提取高純度的PCB是一項復(fù)雜且不經(jīng)濟的方法，而采用合成生物學(xué)的方法合成PCB具有降低成本、節(jié)約能源和提高純度的優(yōu)點，目前已有研究人員在5 L發(fā)酵罐實現(xiàn)了PCB世界最高水平合成。

Strategy

首先，通過比較選擇了來源于T. elongatus的HO1和來源于Synechocystis sp的PcyA來合成PCB，在此基礎(chǔ)上，確定了含有強誘導(dǎo)啟動子(T7lac)的高拷貝數(shù)質(zhì)粒(pRSFDuet-1)最適合表達這兩種酶(圖1，圖2)。

▲圖1 用于PCB合成的模塊?；疑珔^(qū)域包括參與ALA替代途徑（C4或C5途徑）的酶合成；紅色區(qū)域包括參與血紅素合成的酶和中間體；藍色區(qū)域包括參與PCB合成的酶和輔酶因子。

Figure 1. Modules for PCB synthesis. The gray block includes the enzymes involved in the alternative pathways (C4 or C5 pathway) for ALA synthesis; the red block includes enzymes and intermediates involved in heme synthesis; the blue block includes enzymes and cofactors involved in PCB synthesis.

▲圖2優(yōu)化HO和PcyA的表達策略以合成藻藍素。（a）從不同來源選擇HO和PcyA；（b）HO1和PcyA表達的質(zhì)粒和啟動子的優(yōu)化。藍色和深灰色條表示PCB和分別為OD600。

Figure 2. Optimize the expression strategy of HO and PcyA to synthesize phycocyanin. (a) Selection of HO and PcyA from different sources; (b) optimization of plasmids and promoters for HO1 and PcyA expression. The blue and dark-gray bars represent the concentrations of PCB and OD600, respectively.

此外，在中等拷貝數(shù)的pCDFDuet-1載體中，采用DNA支架以2:1的比例實現(xiàn)HO1和PcyA的有效組裝(圖3)。

▲圖3通過DNA支架調(diào)節(jié)HO和PcyA比例促進藻藍素合成

Figure 3. Regulation of HO and PcyA ratio by the DNA scaffold to improve PCB synthesis.

隨后，通過直接補充血紅素前體ALA和適度過表達血紅素生物合成途徑中的關(guān)鍵酶(HemB和HemH)，增加細胞內(nèi)前體物質(zhì)供應(yīng)，促進PCB合成。由于催化血紅素合成PCB的兩步酶促反應(yīng)都伴隨著鐵氧還蛋白（Fd）和Fd-NADP+還原酶（Fnr）的循環(huán)再生，研究人員通過表達nadK基因（編碼NAD+激酶）來加速輔因子循環(huán)，進一步增強了PCB合成（圖4）。

▲圖4 PCB合成中的輔因子增強循環(huán)

Figure 4. Enhanced cycle of cofactors for PCB synthesis.

此外，研究人員還通過添加還原劑作為輔助，發(fā)現(xiàn)當(dāng)培養(yǎng)基中加入維生素C或谷胱甘肽時，藻藍素產(chǎn)量會得到提高，進一步優(yōu)化了維生素C的添加量，發(fā)現(xiàn)添加5 g/L維生素C時，最適合PCB生產(chǎn)。

最后，分別在搖瓶和發(fā)酵罐水平對發(fā)酵條件進行優(yōu)化（圖5）。

▲圖5在5L發(fā)酵罐中放大分批和補料分批發(fā)酵。（a）分批發(fā)酵；（b）600g補料分批發(fā)酵/L葡萄糖和8g/L MgSO4·7H₂O；（c）通過添加600 g/L葡萄糖、8 g/L MgSO₄·7H₂O和200 mg/L FeSO₄·7H₂O進行補料分批發(fā)酵；（d）通過添加600 g/L葡萄糖、8 g/L MgSO₄·7H₂O、200 mg/L FeSO₄·7H₂O和5 g/L(NH₄)₂SO₄進行補料分批發(fā)酵

Figure 5. Scale-up batch and fed-batch fermentation in a 5 L fermenter. (a) Batch fermentation; (b) fed-batch fermentation by feeding with 600 g/L glucose and 8 g/L MgSO₄·7H₂O; (c) fed-batch fermentation by feeding with 600 g/L glucose, 8 g/L MgSO₄·7H₂O, and 200 mg/L of FeSO₄·7H₂O; (d) fed-batch fermentation by feeding with 600 g/L glucose, 8 g/L MgSO₄·7H₂O, 200 mg/L of FeSO₄·7H₂O, and 5 g/L (NH₄)₂SO₄

在搖瓶水平，在30℃條件下用0.8 mM IPTG誘導(dǎo)，采用含有200mg/L ALA、20 mg/L FeSO4·7H?O和5 g/L維生素C的MR培養(yǎng)基有利于提高PCB的產(chǎn)量。在發(fā)酵罐水平，采用pH-stat法進行補料分批發(fā)酵，添加600g/L葡萄糖、8g/L MgSO4·7H?O和200 mg/L FeSO4·7H?O，在發(fā)酵罐水平獲得藻藍素28.32 mg/L，是至今報道的最高產(chǎn)量。此研究為在大腸桿菌中合成藻藍素或血紅素衍生物及其他天然色素提供了策略。

03

Conclusion

提取耗能大、純化復(fù)雜且原料獲取周期長的藻藍素通過生物合成的方法實現(xiàn)了目前發(fā)酵最高的產(chǎn)量，以大腸桿菌為工程菌成功構(gòu)建PCB完整代謝通路，通過基因調(diào)控手段（過表達關(guān)鍵酶及相關(guān)酶上游基因等）和輔料添加來促進PCB的合成，再于生物反應(yīng)器內(nèi)對菌種進行放大培養(yǎng)并對培養(yǎng)條件進行優(yōu)化，采取補料分批發(fā)酵的方法在5 L發(fā)酵罐水平獲得了PCB的高產(chǎn)量合成。

合成生物學(xué)是從原料到菌種再到產(chǎn)品的全鏈條設(shè)計和優(yōu)化，可以在改造和優(yōu)化天然表達體系的同時，將動物源和植物源的代謝路徑構(gòu)建到微生物體系中，重新合成全新的人工生物體系，最終實現(xiàn)目標(biāo)代謝物的異源表達，將原料以較高的速率最大限度地轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物。而平行生物反應(yīng)器是合成生物學(xué)產(chǎn)業(yè)化關(guān)鍵技術(shù)工藝設(shè)計方案重要的環(huán)節(jié)，其核心功能是高通量篩選和工藝放大，研究目標(biāo)菌種在較大培養(yǎng)體系下的生長行為，優(yōu)化生長pH、補料速度、攪拌速度、誘導(dǎo)劑添加、通氣量等培養(yǎng)條件，實時監(jiān)測體系內(nèi)溶氧、溫度等生長參數(shù)，多個反應(yīng)器同時控制，使發(fā)酵過程一致，發(fā)酵結(jié)果具有一致性與平行性。“新芝·主元”MPB平行生物反應(yīng)器，針對不同培養(yǎng)需求設(shè)計開發(fā)了500 mL、1000 mL和2400 mL三款不同容積的發(fā)酵設(shè)備，單元模塊數(shù)量可按需拓展，適用于菌種的發(fā)酵工藝優(yōu)化、工藝固定的菌種高通量篩選、最適培養(yǎng)基篩選等方向，涉及基因工程、生物制藥、酶工程、合成測序、代謝途徑/ 網(wǎng)路及生物底盤的設(shè)計與改造等多個領(lǐng)域。平行生物反應(yīng)器上下游行業(yè)廣泛，是研究合成生物學(xué)的得力助手，如有興趣，期待您的咨詢。

圖源：DOI: 10.1021/acssynbio.2c00016